Знакомство со штаммами продуцентами используемыми в

Ссылки на отдельные патенты, знакомство с которыми может быть очень Используемый для создания химических вакцин методический уровень . штаммы-продуценты, способы получения плазмид и штаммов, способы. микроорганизмов, клеток и тканей растений; знакомство с основными эколо . бования, предъявляемые к штаммам – продуцентам микробного белка. ние рефератов, составление словариков терминов, используемых в данной. знакомство обучающихся с разнообразием биологических объектов, Разнообразие биологических объектов, используемых в промышленной . Требования, предъявляемые к штаммам – продуцентам микробного белка. Раздел.

Было показано, что при использовании данного штамма в качестве реципиента можно получить более высокий выход продукта [74]. У данного штамма полностью утрачена способность расти на метаноле [75].

Методы повышения продаж 2

Иногда, при культивировании в ферментерах, где достигается высокая плотность биомассы, происходит частичный лизис клеток, с последующим высвобождением эндогенных протеолитических ферментов. С целью уменьшить протеолитическую деградацию секретируемых в культуральную среду белков, были получены мутантные штаммы по некоторым протеазам.

Например, штаммы SMD his4 pep4 prb1SMD his4 prb1SMD his4 pep4 обеспечивают более стабильные условия для секреции рекомбинантных белков в культуральную среду. Ген вакуольной пептидазы А pep4отвечает за активацию карбоксипептизазы Y и протеиназы B.

Поэтому у мутантов pep4 сильно снижена активность протеиназы А и карбоксипептидазы Y, и частично снижена активность протеазы В, в то время, как у двойных мутантов pep4prb1 практически отсутствует активность всех трех протеаз [75].

В таблице 1 приведена более полная, сводная информация, включающая название штамма, его генотип, фенотип.

ЭФФЕКТИВНОЕ ПАТЕНТОВАНИЕ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Phis4 Mut - His - При выборе штамма для гетероэкспрессии руководствуются как свойствами определенного мутанта, так и целевого продукта, который необходимо получить. Поскольку метанольная регуляция в метилотрофных дрожжах является ключевым моментом с точки зрения использования мощных промоторов ферментов, участвующих в метаболизме метанола, особое внимание на можно уделить рассмотрению деталей этой регуляции.

На сегодняшний день известны два метаболических пути утилизации метанола: Как иллюстрирует схема приведенная на рис. Локализиванная в пероксисоме алкогольоксидаза 1 является октамером и состоит из 8 идентичных субъединиц, содержит FAD в качестве кофактора [55].

В результате окисления метанола алкогольоксидазой образуются формальдегид и пероксид водорода. Пероксид водорода является субстратом для пероксисомной каталазы и расщепляется на воду и кислород. На этапе образования формальдегида метаболический путь утилизации метанола образовывает две ветви: Часть формальдегида переходит в цитоплазму для дальнейшего окисления по диссимиляционному пути, а часть остается в пероксисоме, вступает в реакцию конденсации с ксилулозофосфатом, который транспортируется в пероксисому возможно посредством активного транспорта.

Реакцию формальдегида с ксилулозо фосфатом катализирует пероксисомальная дигидроксиацетонсинтаза, и эта реакция является первой в ассимиляционном пути [56]. В результате этой реакции фруктозо-1,6-дифосфат подвергается дефосфорилированию фруктозо Примерно треть образовавшегося GAP расходуется на формирование клеточной массы.

Остальная часть возможно участвует в образовании ATP через цикл трикарбоновых кислот и окислительное фосфорилирование для поддержания энергетичекого баланса клетки рис. Метаболический путь утилизации метанола. В диссимиляционном пути часть формальдегида, полученного в результате окисления метанола, транслоцируется в цитоплазму, в виде S- гидроксиметилглутатиона, который возникает в результате некатализируемой реакции восстановленного глутатиона и формальдегида рис.

Образующийся в ходе реакции S-формилглутатион является нестабильным соединением и в водных растворах произвольно гидролизуется до формиата и GSH [60]. Далее S-формилглутатион гидролизуется до муравьиной кислоты и глутатиона S-формилглутатионгидролазой.

Последний этап диссимиляции метанола, NADзависимое окисление формиата до углекислого газа, катализирует формиатдегидрогеназа. Две молекулы NADH, получающиеся в результате диссимиляционного пути утилизации метанола эквивалентны четырем молекулам ATP образующимся в результате окислительного фосфорилирования в митохондрии.

Таким образом, можно сказать, что энергетический эквивалент диссимиляции метанола равен четырем молекулам ATP [62]. У метилотрофных дрожжей, растущих на метаноле, наблюдается высокая активность цитоплазматических дегидрогеназ формальдегида и формиата, а активность большинства ферментов цикла Кребса ниже, чем при росте на полиуглеродных субстратах [61]. Эти данные позволяют говорить о том, что в условиях роста на метаноле основная часть NADH, необходимого для синтеза ATP, образуется вне митохондрий.

С другой стороны, мутантные штаммы H. Учитывая, что в результате работы этих ферментов генерируются две молекулы NADH, можно предположить, что работа цикла трикарбоновых кислот является необходимой также и в условиях роста на метаноле, и что диссимиляционный путь утилизации метанола может выполнять скорее функцию детоксификации, нежели чем функцию генерации энергии в виде NADH [59].

В пользу последнего утверждения 22 23 свидетельствует также и то, что энергия, полученная в результате диссимиляции метанола в цикле трикарбоновых кислот равняется 5,3 моль в эквиваленте ATP в расчете на 1 моль метанола, что больше в сравнении с 4 моль ATP, полученные в результате прямой, окислительной диссимиляции метанола [62]. В связи с тем, что внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для NADH, возникает проблема окисления восстановленного кофермента.

В настоящее время неизвестно, каким образом происходит окисление цитоплазматического NADH в клетках дрожжей P. Активные центры этих ферментов обращены в межмембранное пространство, поэтому они способны окислять внемитохондриальный NADH и обеспечивать транспорт электронов молекуле убихинона.

Передача электронов от цитоплазматического NADH в митохондриальную цепь переноса электронов может, вероятно, осуществляться при помощи челночного механизма, например, глицерофосфатного. В этом случае NADH реагирует в цитоплазме с DHA-фосфатом, в результате реакции, которую катализирует глицерофосфатдегидрогеназа, образуется 3- глицерофосфат, легко проникающий в митохондрии.

При помощи фермента, глицерофосфатдегидрогеназы, GAP окисляется до DHA-фосфата, который возвращается в цитоплазму, а восстановленный флавопротеид передает приобретенные электроны убихинону [61]. Нарушение диссимиляционного пути утилизации метанола может приводить к замедленному росту клеток на данном субстрате. Например, делеция гена AOX1 приводит к проявлению фенотипа mut s methanol utilization slowly [].

Медленный рост обусловлен действием фермента, кодируемого геном АОХ2, который обладает значитально меньшей активностью в сравнении с алкогольоксидазой Aox1p.

При этом клетки не способны утилизировать метанол []. Все векторы включают следующие элементы: Одним из очевидных условий применения какой-либо экспрессионной системы для гетерологичной экспрессии является наличие способа отбора трансформантов.

Для отбора пользуются отличительными фенотипическими признаками, которые приобретают трансформанты вместе с новым генотипом. Это может быть устойчивость к какому-либо антибиотику, определенная ферментативная активность напр.

Для биотехнологического применения штамма реципиента предпочтительнее более экономичный способ, который не предусматривает применения дорогостоящих антибиотиков или субстратов. Соответственно, выбранный нами для гетерологичной экспрессии дикий штамм ВКПМ Y было необходимо модифицировать для того, чтобы иметь возможность отбирать трансформантов по комплементации определенных ауксотрофностей. Для этого необходимо привнести в данный штамм мутации, чтобы обеспечить ауксотрофность штамма по ряду субстратов.

Например, мутанты по гену URA3, кодирующему ородитиндегидрогеназу, утрачивают способность синтезировать урацил, соответственно расти на средах без добавления урацила. Таким образом, используя данный фенотип, можно легко отбирать трансформанты по комплиментации данной ауксотрофности геном URA3, клонированным в вектор для трансформации. Для конструирования и амплификации плазмиды в клетках бактерий векторы включают в себя также бактериальный репликон, гены устойчивости к 24 25 соответствующему антибиотику в клетках E.

Репликативные векторы несут в своем составе последовательности хромосом дрожжей, способные к автономной репликации ARS. В состав репликативных векторов входит фрагмент природной плазмиды дрожжей-сахаромицетов 2 мкм ДНКкоторый отвечает за репликацию плазмиды в клетках дрожжей. Стабильность вектора можно значительно повысить, включив в его состав одну из центромерных последовательностей хромосом дрожжей. Однако количество копий такой плазмиды падает до на клетку [50].

Поэтому их целесообразно использовать для клонирования тех генов, высокий уровень экспрессии которых может оказаться токсичным для клетки дрожжей.

Репликативные плазмиды чаще всего используют для экспрессии чужеродных генов в дрожжах S. Для конструирования и амплификации плазмиды в клетках бактерий, в состав конструкции входят бактериальный репликон и гены устойчивости к соответствующему антибиотику. Для контроля экспрессии целевого гена, также входящего в конструкцию с предварительно оптимизированным профилем используемых кодоновиспользуются, например, промоторы генов, кодирующих гликолитические ферменты, либо ферменты метаболического пути утилизации метанола.

Количество репликативных плазмид в клетке зависит от используемой последовательности ARS. Например, репликативные векторы с фрагментом 2 мкм плазмиды в качестве ARS поддерживаются в клетке в количестве копий. При длительном культивировании не представляется целесообразным применение таких плазмид из-за их митотической нестабильности. Наряду с репликативными векторами, также используются интегративные векторы, которые также содержат селективные маркеры, и необходимые элементы бактериальный репликон, гены устойчивости к соответствующему антибиотику для 25 26 конструирования и амплификации плазмиды в клетках бактерий.

Наличие в составе такого вектора последовательности гена рибосомальной РНК или Ту-транспозона, которые присутствуют в геноме дрожжей в количестве и копий, соответственно, позволяет получать множественные встройки интересующего гена [25]. Уровень продукции гетерологичного белка при использовании таких мультикопийных интегрантов может быть выше, чем у трансформантов, несущих много копий репликативных плазмид [51]. Интегративные векторы чаще используют для трансформации метилотрофных дрожжей, в частности K.

Целевой ген и регуляторные элементы, отвечающие за регуляцию его экспрессии также входят в состав вектора. Отличительной особенностью данных векторов является наличие флангов нуклеотидных последовательностей п. Полученные в результате трансформации такими конструкциями интегранты значительно стабильнее. Одним из очевидных преимуществ дрожжевых систем экспрессии перед бактериальными является способность дрожжей к эффективной секреции белков в культуральную среду.

Многие рекомбинантные белки, продуцируемые в дрожжевых культурах, являются секреторными и способны приобрести нативную конформацию в результате определенных посттрансляционных модификаций, которые возможны только при прохождении секреторного пути.

Секреция гетерологичного белка значительно упрощает его очистку, а также позволяет избежать возможного 26 27 токсического влияния продукта на клетку дрожжей. Существуют многочисленные примеры успешного использования дрожжей для продукции секреторных белков легких цепей антител, рецептора эритропоэтина, тромбомодулина, желудочной липазы, коллагеназы фибробластов, интерлейкина 8, интерферона [40].

Возможность секреции того или иного белка у дрожжей, как и у высших эукариота, определяется наличием на N-конце дополнительной аминокислотной последовательности, получившей название сигнальной или лидерной. Именно эта последовательность обеспечивает последовательную транслокацию секреторного белка в эндоплазматический ретикулум ЭРаппарат Гольджи АГсекреторные везикулы, на поверхность клетки. В процессинге секреторных белков дрожжей и гетерологичных белков непосредственное участие принимают протеазы.

Сразу после транслокации полипептидной цепи в полость ЭР происходит отщепление сигнальной последовательности или, в случае использования лидерного пептида, например, - фактора, про-последовательности при помощи сигнальной пептидазы КФкоторая находится на внутренней стороне мембраны ЭР. Сигнальная пептидаза дрожжей представляет олигомерный комплекс, состоящий из четырех субъединиц 13, 18, 20 и 25 кда.

ЭФФЕКТИВНОЕ ПАТЕНТОВАНИЕ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Эффективность удаления лидерной области является необходимым условием эффективной секреции, так как в противном случае в основном гидрофобная последовательность аминокислотных остатков, образующих лидерную область может препятствовать секреции и быть причиной неправильного фолдинга. Для секреции гетерологичных белков эффективно используют пре-про-пептид -фактора, который обеспечивает посттрансляционную транслокацию полипептидных цепей в ЭР [41].

Зрелый -фактор, состоящий из 13 аминокислот, является феромоном, который секретируют клетки дрожжей S. Ген MF l кодирует структуру пре-про- -фактора, белка, состоящего из аминокислот, включающего сигнальную пре- последовательность 19 аминокислотпро-последовательность с тремя сайтами N-гликозилирования 66 аминокислотчетыре повтора зрелого -фактора 13 аминокислот.

При процессировании пре-про- -фактора 27 28 участвуют четыре различных протеазы: Далее, -фактор подвергается расщеплению дипептидиламинопептидазой StelЗркоторая удаляет повторы глутаминовая аспарагиновая кислота - аланин на N-конце пептида, и карбоксипептидазой Kexlp ЕСкоторая отщепляет остатки лизина и аргинина на С-конце первых трех повторов -фактора [42].

Потенциал препаратов “Best-Sil”: первое знакомство и почему с ними удобно работать?

Также, для получения секретируемых гетерологичных белков в клетках K. Часто секреция является лимитирующим фактором при продуцировании клеткой экзогенного белка. С целью оптимизации секреции используют модифицированные пре- и про-области, дающие существенное увеличение целевого белка на выходе [43]. Также, использование дипептидного линкера, помещенного после сайта процессинга Kex2 протеазы, способствует более полному отщеплению про-области -фактора [44]. В некоторых случаях целесообразно использовать собственную лидерную область целевого белка.

Было показано, что секреция ацидофильной ксилоназы из Aureobasidium pullulans в клетках Pichia pastoris более эффективна при использовании собственной лидерной области, а также от -MF, чем при использовании про-области PHO1 [45]. В случае, когда на N-конце зрелого белка находится аргинин или лизин, что затрудняет процессинг белка предшественника протеазой Kex2, можно с достаточной эффективностью использовать лидерный пептид от сывороточного альбумина, как было показано для эффективной секреции рекомбинантного ингибитора трипсина [46].

Таким образом, несмотря на то, что в среднем, -факторная пре-про-область способна почти гарантированно обеспечить получение целевого секретируемого белка, выбор лидерного пептида для каждого конкретного рекомбинантного белка является задачей, требующей эмпирического подхода. Регуляция промотора AOX1 посредством активатора трансктипции Mxr1p Промотор алкогольоксидазы AOX1 является одним из самых мощных, точно регулируемых промоторов, вследствие чего и является одним из самых используемых в биотехнологии регуляторных элементов для метилотрофных дрожжей.

Показано, что в клетках P. Для активация экспрессии гена требуется не только отсутствие репрессирующего источника углерода глюкозыпри котором наблюдается просто отсутствие катаболитной репрессии то есть состояние дерепрессии, но и обязательное наличие индуктора в данном случае метанола. Такая регуляция транскрипции гена АОХ1 играет решающую роль при экспрессии гетерологичных генов, клонированных под контролем АОХ1 промотора, поскольку такая регуляция позволяет разделить стадии роста культуры и синтеза рекомбинантного белка.

Первые дни благодаря брожениям в пакетах накапливаются газы, которые желательно откачивать. Примерно через неделю активное газообразование заканчивается. Отбор проб для лабораторного анализа можно осуществлять в любое время, но желательно провести это одновременно во всех вариантах через дней после закладки опыта.

Для увеличения достоверности полученных результатов и с учетом выравненности посевов кормовых культур в каждом варианте можно использовать по нескольку вакуумных пакетов повторностей.

Для оценки эффективности консерванта при силосовании мы рекомендуем использовать следующую схему испытания: Анализ исходной зеленой массы, отобранной в момент закладки испытания; Анализ образца корма из вакуумного пакета без применения консерванта; Анализ образца корма из вакуумного пакета с применением консерванта; Анализ образца корма из производственной партии, заложенной с консервантом.

Сравнительный анализ результатов испытаний с высокой достоверностью доказывает эффективность применения консервантов в идеальных и производственных условиях, включая накопление кислот, снижения рН, величину потерь питательных веществ и сырого протеина, которые возникают при силосовании, помогает увидеть узкие места в используемой технологии заготовки.

Современный и достоверный анализ качества кормов Получение достоверной информации о качестве кормов неразрывно связано с использованием современных лабораторий. Высокое качество и достоверность анализов сегодня могут гарантировать далеко не все лаборатории.

Одним из наиболее востребованных и продвинутых методов является анализ с помощью инфракрасного сканирования NIRS и последующей расшифровки спектров с использованием специальных калибровочных баз данных. Данный метод получил широкое распространение в развитых странах Европы, а также в США.

В России такой анализ быстро и недорого можно сделать с года в лаборатории Еврофинс Агро тестинг, г. Мы сами пользуемся услугами и рекомендуем другим эту лабораторию. На базе протоколов, полученных из лаборатории, мы формируем общую библиотеку данных по качеству объемистых и концентрированных кормов хозяйств для анализа и совершенствования системы кормопроизводства предприятий, а также помогаем рассчитывать рационы кормления животных.

Консультирование и сопровождение Рекомендуя использовать наши консерванты при заготовке кормов мы предлагаем также широкий пакет сопровождения, который включает в себя услуги как до, во время, так и после кормозаготовительной кампании.

Их можно разделить на два блока. К первому мы относим услуги по совершенствованию системы кормопроизводства в целом, если имеющиеся результаты не соответствуют потребностям животноводства. Основные инструменты — анализ системы кормопроизводства, поиск узких мест, совместное планирование по улучшению ситуации. По данным предприятия изучается структура посевов и заготовки кормовых культур, урожайность, сроки и продолжительность заготовки кормовых культур, производительность звеньев на заготовке, погодно-климатические условия для данной территории, и.

Для изучения пределов развития отдельных технологий использовали методологию логического системного анализа [12]. Технические решения, созданные в процессе конструирования таких средств, рассматривали как совокупность элементов, находящихся между собой в определенной зависимости и составляющих некоторое единство целостностьто есть систему. Данную систему расчленяли на отдельные подсистемы, представляющие собой конкурирующие, альтернативные направления типовые приемыи оценивали возможности условной биотехнологической фирмы по созданию технических решений.

Затем прогнозировали принципы функционирования и структуру эффективных охраноспособных технических решений, а также эффективные подходы к их патентной защите.

Селекция продуцентов - PDF

В тексте при ссылке на патент указано сокращенное наименование патентного ведомства, номер патентного документа. Ссылки на отдельные патенты, знакомство с которыми может быть очень полезным, вынесены в список использованных источников.

Освоение отдельных ключевых технологий выделены двойной линией предоставляет организации определенный диапазон возможностей по патентованию своих изобретений [10]. Пределы развития технологий специфической профилактики инфекционных болезней. Технологии конструирования традиционных вакцин предполагают конструирование живых, убитых и химических вакцин [13]. Методический уровень, используемый для конструирования первых двух типов вакцин, более характерен для периода конца XIX века и начала х годов XX века.

Объекты защиты — вакцинные штаммы, способы аттенуации вирулентных штаммов возбудителя, для убитых вакцин — их композиции с адъювантами, консервантами и лимфокинами; отдельные технологические процессы, обеспечивающие наработку микробной биомассы; питательные среды и компоненты для них; способы контроля качества вакцин, питательных сред и др. Используемый для создания химических вакцин методический уровень характерен для периода от начала до середины х годов XX столетия. Получение антигенов, как правило, осуществляется из среды культивирования токсины, слизь, ферментылибо из убитых клеток.

В настоящее время в рамках данных технологий осуществляется патентование вакцин только ветеринарного назначения. Фракционирование иммуногенных белков субъединиц микроорганизмов. Освоение технологии в виде различных приемов хроматографического разделения белков предполагает эмпирический поиск протективных антигенов их эпитопов среди белков и гликопротеинов вирусов и бактерий.

Как правило, антигены, включенные в вакцины, охарактеризовываются в патентных притязаниях по физико-химическим и иммунологическим свойствам, позволяющим проводить их идентификацию в смесях других биополимеров.

Патентуемые изобретения решают задачи снижения токсичности антигенных белков и повышения их иммуногенности. Объекты патентования — композиции или соединения, включающие антиген и компоненты, способствующие его эффективной презентации иммунной системе [9]. Клонирование отдельных генов антигенов и их фрагментов. Технология с конца х годов используется для конструирования вакцин против возбудителей инфекционных заболеваний, представляющих собой ДНК-вирусы, бактерии и риккетсии.

Для этого гены антигенов клонируются в вирусные и бактериальные векторы, частицы HBsAg [14]. Другим направлением, реализующим заложенный в данной технологии изобретательский потенциал, является повышение уровня экспрессии и секреции генов клонированных антигенов.

Оно находит свое выражение в появлении патентов на векторы экспрессии и способы очистки антигенов, основанные на тонких методах фракционирования биополимеров ЕР В рамках этой же технологии осуществляется поиск а соответственно и патентование новых продуцентов культуры тканей эукариот, метилотрофные дрожжи, трансгенные растения и животные и др.

Синтезированные в различных системах экспрессии антигены также включаются в состав композиций, усиливающих иммунный ответ [9]. Освоение технологии позволяет организации осуществлять клонирование генов РНК-вирусов [8]. Возможности и ограничения те же, что мы отметили при рассмотрении предыдущей технологии.

Обе характеризуют методический уровень х годов. Химический синтез генов наиболее активно начал использоваться для получения генов антигенов со второй половины х годов. Освоение технологии позволяет осуществлять конструирование генов антигенов, состоящих из нескольких эпитопов [9].

Но в тоже время выход организации на этот уровень является своеобразным индикатором исчерпания возможностей традиционной технологии рекомбинантной ДНК, и, соответственно, предстоящего снижения патентной активности по объекту. Технология используется со второй половины х годов для удаления из антигенных пептидов сайтов расщепления протеазами, изменения конформации эпитопов, снижения токсичности антигенов ЕР Объектами патентования являются антигены [9].

Однако, как и при использовании химического синтеза генов, применение разработчиками белковой инженерии для создания новых технических решений свидетельствует о предстоящем снижении патентной активности по объекту. Вакцины на основе синтетических линейных пептидов патентуются с начала х годов. Освоение технологии пептидного синтеза позволяет организации осуществлять патентование синтетических аналогов протективных эпитопов, в том числе одновременно соответствующих нескольким природным антигенам.

Низкая иммуногенность синтетических пептидов подталкивает разработчиков к совершенствованию способов их представления иммунной системе, например, путем включения в липосомы, образования конъюгатов и композиций с иммуномодуляторами, введения в их структуру участков, узнаваемых Т- и или В-лимфоцитами и др. Синтез пептидов с третичной структурой.

Под данной технологией понимается конструирование пептидов с искусственно приданной конформацией циклизация пептидов, соединение двух и более пептидов поперечными сшивками, синтез разветвленных пептидов и др. Технология используется с первой половины х годов для воспроизведения или имитирования сложных эпитопов [16].